微流控芯片技術是20世紀90年代中期建立起來的一種新的微型化快速分析平臺，它是通過微細加工技術在芯片上構建由儲液池、微反應室、微管道等微功能元件構成的微流路系統(tǒng)，加載生物樣品和反應液后，在壓力泵或者電場作用下形成微流路，于芯片上進行一種或連續(xù)多種的反應，達到對樣品高通量快速分析的目的。微流控芯片的加工方法有很多種，傳統(tǒng)的微流控芯片是以硅片作為基底材料，通過光刻技術高精密度地復制二維圖形，這種方法可以獲得高精密度的微流控芯片，但是光刻技術存在對加工環(huán)境要求高、加工成本高以及加工周期長等缺點。本實驗以聚甲基丙烯酸甲酯為基底材料，通過CO2激光直接加工的方法制備微流控芯片，并用于免疫分析。
    1  實驗方法
    1.1  儀器與試劑PMMA（上海天進塑膠制品有限公司）、CO2激光器（洛陽天方設備有限公司）、BPCL-2-KGC微弱發(fā)光測量儀及分析軟件（中科院生物物理研究所）、HL-2恒流泵（上海滬西分析儀器公司）、羧基磁珠（山東滋博赫茲生物公司）、AFP抗體（武漢博士德公司）、AFP 標準品(Sigma公司）、辣根過氧化物酶標記的AFP抗體（深圳晶美公司）、魯米諾（Sigma）。
    1.2  激光加工裝置的構建  激光加工裝置主要由計算機控制系統(tǒng)、開關電源、冷卻水循環(huán)、CO2激光器和光學光路、電路系統(tǒng)6個部分組成。其結構圖如圖1所示。CO2激光器購自洛陽天方設備有限公司，激光的波長10.6um，輸出功率0~50W，工作模式是連續(xù)運行。在本系統(tǒng)中，激光器固定，激光器產(chǎn)生的激光通過聚焦棱鏡聚焦在芯片基底上，將設計的微流路CAD圖形轉換成準分子激光微加工系統(tǒng)可識別的指令，通過工作臺的運動來完成芯片加工。聚焦透鏡的焦距是20mm。采用北京新立龍軟件有限公司的新立龍軟件對系統(tǒng)進行控制。

     1.3.1  基片的清洗   根據(jù)所設計的芯片大小，截取一定面積的PMMA基片，放置于裝有三蒸水的玻璃燒杯中，置于超聲清洗器中進行清洗，一共清洗3次，每次清洗5min，以除掉PMMA基片表面黏附的灰塵和其他雜質。清洗完成后，用高純N2流吹干。
     1.3.2  激光加工   采用三維輔助設計軟件（AutoCAD）設計微流路圖形，將洗凈的PMMA基片放置于激光加工裝置的固定平臺上，打開激光加工裝置的電源，打開激光器的冷卻循環(huán)水電源，設置好激光器的強度和激光的掃描速度，將設計的微流路CAD圖形轉換成準分子激光微加工系統(tǒng)可識別的指令，采用激光微加工系統(tǒng)在聚甲基丙烯酸甲酯基片表面獲得微流路，采用同樣的方法加工具有進樣口和出樣口的芯片蓋片。
     1.3.3  微流控芯片的表面修飾   將加工好的芯片在異丙醇溶液超聲清洗，然后用160g/L的氫化鋁鋰乙醚溶液對通道表面進行處理30min，處理完成后再分別用異丙醇和三重蒸餾水進行超聲清洗，用高純N2流吹干。
     1.3.4  熱壓鍵合   將處理好的芯片與基片置于熱壓裝置兩片玻璃片之間，放入簡易熱壓裝置，壓緊，88~95攝氏度，1.0~1.4壓力下熱鍵合30min獲得完整的芯片。
    1.4  微流控芯片用于免疫分析的研究" 將加工好的微流控芯片及其與其相連的外部管道置于一密封艙內，以恒流泵控制管道內流體的流動。以甲胎蛋白（alpha-fetoprotein,AFP）為檢測對象，采用雙抗夾心免疫分析法進行檢測，以超順磁珠作為固化抗體的載體，電磁場控制超順磁珠的吸附與釋放，以辣根過氧化物酶-魯米諾化學發(fā)光系統(tǒng)顯示免疫反應。信號檢測處理系統(tǒng)采用BPCL-2-KGC微弱發(fā)光測量儀對免疫反應的化學發(fā)光信號進行放大及分析。
    2  實驗結果
    2.1  激光加工強度與激光加工次數(shù)對微流控芯片通道的影響
    2.1.1  芯片通道深度與激光強度的關系  在其他條件不變的情況下，改變激光強度觀察通道深度變化的情況，在加工過程中激光強度達到5W時才開始在PMMA材料上燒蝕出條紋，以后隨著激光束強度的增加，通道深度也隨著線性增加（圖2）。

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    2.1.2  芯片通道深度與激光加工次數(shù)的關系  我們將激光強度固定在25W，觀察芯片通道深度的變化。在激光強度固定不變的情況下，芯片通道深度隨著激光加工次數(shù)的增加而增加（圖3），由于激光加工速度很快，流道很窄，激光加工過程中氣化的材料沒揮發(fā)出去又重新凝結在壁面，因此芯片通道深度并不是隨著激光加工的次數(shù)而成倍增長。
    2.1.3  氫化鋁鋰對通道的修飾作用   采用激光微加工PMMA獲得的芯片通道表面比較不平整度較大，通道壁黏附有PMMA氣化以后留下的殘渣，必須要對通道進行處理。首先將加工好的芯片放于裝有三重蒸餾水的玻璃燒杯中進行超聲清洗，一共需要超聲清洗3次，以除掉通道壁黏附的殘渣。然后在微通道中加入160g/L的氫化鋁鋰乙醚溶液，氫化鋁鋰與PMMA發(fā)生劇烈反應，產(chǎn)生大量的氣泡，隨后在通道內有大量的白色沉淀生成，進行超聲清洗后在體視顯微鏡下可以觀察到通道表面的不平整度降低了，說明氫化鋁鋰對通道表面有鈍化作用（圖4）

    2.2  微流控芯片用于免疫分析的研究   我們采用該系統(tǒng)對AFP進行了雙抗體夾心化學發(fā)光免疫分析，圖5是AFP濃度分別為0、10、20、40、60、80、100ng/mL 時用該系統(tǒng)測得的化學發(fā)光曲線。在去除試劑空白后，以AFP 濃度為橫坐標，各濃度AFP化學發(fā)光曲線的積分值為縱坐標制備標準曲線，其線性回歸方程為：AFP濃度（ ng/mL）=化學發(fā)光積分值*3.64X10*-6-0.22，相關系數(shù)為O.998，表明該系統(tǒng)可以用于免疫分析。